用作沼氣發酵原料的有機物種類繁多，如禽畜糞便、作物秸稈、食品加工廢物和廢水，以及酒精廢料等，其主要化學成分為多糖、蛋白質和脂類。
其中多糖類物質是發酵原料的主要成分，它包括淀粉、纖維素、半纖維 素、果膠質等。這些復雜有機物大多數在水中不能溶解，必須首先被發酵細菌所分泌的胞外酶水解為可溶性糖、肽、氨基酸和脂肪酸后，才能被微生物所吸收利用。發酵性細菌將上述可溶性物質吸收進入細胞后，經過發酵作用將它們轉化為乙酸、丙酸、丁酸等脂肪酸和醇類及一定量的氫、二氧化碳。在沼氣發酵測定過程中，發酵液中的乙酸、丙酸、丁酸總量稱為中揮發酸（TVA）。蛋白質類物質被發酵性細菌分解為氨基酸，又可被細菌合成細胞物質而加以利用，多余時也可以進一步被分解生成脂肪酸、氨和硫化氫等。蛋白質含量的多少，直接影響沼氣中氨及硫化氫的含量，而氨基酸分解時所生成的有機酸類，則可繼續轉化而生成甲烷、二氧化碳和水。脂類物質在細菌脂肪酶的作用下，首先水解生成甘油和脂肪酸，甘油可進一步按糖代謝途徑被分解，脂肪酸則進一步被微生物分解為多個乙酸。
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