Readilink iFluor 647蛋白標記試劑盒提供了一種以微觀方式標記抗體的便捷方法。該試劑盒僅需要兩個簡單的混合步驟而無需純化步驟。 試劑盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亞AN酯（SE）顯示出與蛋白質的脂族AN的良好反應性和選擇性，并形成羧酰AN鍵，其與天然肽鍵相同且穩定。 iFluor 和mFluor-抗體綴合物可用于免疫熒光染色，熒光原位雜交，流式細胞術和其他生物學應用。 每個Readilink 抗體標記試劑盒都提供了進行兩次偶聯反應（2x50μg蛋白質）的所有必需成分。 每個試劑盒可用于標記50-100μg單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質（> 10 kDa），只需兩個簡單的混合步驟。Readilink iFluor 647蛋白標記試劑盒是美國AAT Bioquest研發的產品。

標準操作規程（標記50μg蛋白質）

將所有組分加熱并在打開前將樣品瓶短暫離心，并在開始結合前立即準備所需的溶液。 以下SOP是標記抗HDAC IgG抗體的實例。

1.準備蛋白質溶液（溶液A）：

為了標記50g蛋白質（假設目標蛋白質濃度為1mg / mL），將5L（總反應體積的10％）的反應緩沖液（組分B）與50L目標蛋白質溶液混合。

注1.如果您的蛋白質濃度不同，請相應調整蛋白質體積，使~50μg蛋白質可用于標記反應。

注2：為了標記100g蛋白質（假設目標蛋白質濃度為1mg / mL），將10μL（總反應體積的10％）反應緩沖液（組分B）與100μL目標蛋白質溶液混合。

注3：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中;如果蛋白質溶解在甘氨酸緩沖液中，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，10 kDa（來自Millipore的cat＃UFC501008）去除廣泛用于蛋白質沉淀的游離AN或AN鹽（如硫酸AN和乙酸AN）。

注4：不純抗體、牛血清白蛋白（BSA）或明膠穩定的抗體不會被很好標記。

注5：如果蛋白質濃度小于1 mg / mL，則結合效率顯著降低。為獲得標記效率，建議終蛋白質濃度范圍為1-2 mg / mL。

2.運行結合反應：

2.1將蛋白質溶液（溶液A）加入一瓶標記染料（組分A）中，通過反復移液幾次將其混合均勻，或將小瓶渦旋幾秒鐘。

注意：使用標記染料的兩個小瓶（組分A）通過將100μg蛋白質分成2x50μg蛋白質并使每個50μg蛋白質與一小瓶標記染料反應來標記100μg蛋白質。 將兩個小瓶合并用于下一步。

2.2將綴合反應混合物在室溫下保持30-60分鐘。

注意：如果需要，可以旋轉或搖動綴合反應混合物更長的時間。

3.停止共軛反應：

3.1添加5 L（對于50μg蛋白質）或10L（對于100μg蛋白質），其為TQ染色猝滅緩沖液（組分C）的總反應體積的10％到綴合反應混合物中（來自步驟2.2），將它們混合 好。

3.2在室溫下孵育10分鐘。

3.3標記的蛋白質（抗體）現在可以使用了。