Cell Meter 細胞活性檢測試劑盒是美國AAT Bioquest生產的細胞活性檢測試劑盒，Cell Meter檢測試劑盒是一類用于檢測細胞功能的系列工具，包括細胞活性、細胞毒性、細胞凋亡、細胞膜電位以及細胞周期等方面的指標。每種檢測方案均能提供不同熒光顏色的檢測方案。這些檢測方案為從多角度研究細胞功能活動提供了一種十分有效的方法。Cell Meter細胞活力檢測試劑盒 *綠色/紅色雙重熒光* 使用兩種非熒光性指示劑：Calcein AM，用于活細胞；一種非細胞滲透性的DNA結合染料，用于細胞膜不完整的死細胞。Calcein AM是一種疏水性復合物，可以輕易地滲透進入完整的活細胞，通過酯酶的水解作用，產生強烈的熒光。通過細胞內酯酶水解非熒光性Calcein AM，形成具有強烈熒光的親水性Calcein，并且保留在細胞質中。這種酯酶的活性與活細胞數量成比例關系。DNA結合染料極性非常大，不能滲透進入具有完整細胞膜的活細胞，它只有在與死細胞的DNA結合的情況下才發出熒光。生長在培養板中的細胞可以被染料，且在不到兩小時內就可以完成定量分析。本檢測法比其它活細胞檢測法更加強大、穩定。它可以用于許多熒光實驗平臺的高通量分析中，例如微孔板分析，免疫組化和流式細胞術。本試劑盒提供所有必需組分檢測方案。它適合于增殖型和非增殖型細胞，也可用于懸浮和貼壁細胞。96微孔板中，每孔用試劑100ul，本試劑盒提供的試劑足以進行100次檢測；384微孔板中，每孔加試劑25ul，本試劑盒提供的試劑足以進行400次檢測。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優質的Cell Meter 細胞活性檢測試劑盒。 

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流式細胞儀
Ex:	488 nm
Em：	530/30 nm、610/20 nm
通道:	FITC, PE-Texas Red 通道

 

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熒光顯微鏡
Ex:	FITC濾波片組（活），TRITC濾波片組（死）
Em：	FITC濾波片組（活），TRITC濾波片組（死）
推薦孔板:	黑色透明底板

 

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熒光酶標儀
Ex:	490 nm (活), 540 nm (死)
Em：	525 nm (活), 620 nm (死)
Cutoff：	515 nm, 590 nm
推薦孔板:	純黑色孔板

樣品實驗方案

簡要概述

1.用測試化合物制備細胞
2.加入相同體積的CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液（100μL/孔/ 96孔板或25μL/孔/ 384孔板）
3.在室溫或37°C孵育1小時
4.在強度下監測熒光（底部讀取模式）Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）和540 / 620nm（截止= 590nm），帶有FITC濾光片（細胞存活）的熒光顯微鏡和TRITC濾光片 （細胞死亡），或FL1和FL2通道的流式細胞儀。

 

溶液配制

1.儲存溶液配制

        除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。 避免反復凍融循環。
CytoCalcein 綠色原液：
將20μLDMSO（組分C）加入到CytoCalcein Green（組分A）的小瓶中并充分混合以制備CytoCalcein Green原液。 避光。 注意：20μL的CytoCalcein Green原液足以用于一個平板。 存放時，密封管。

 

2.工作溶液配制

將全部內容物（20μL）的CytoCalcein Green儲備溶液和20μL碘化丙啶（組分B）加入10mL測定緩沖液（組分C）中并充分混合以制備CytoCalcein Green /碘化丙錠染料 - 工作溶液。 CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料加工溶液在室溫下穩定至少2小時。 注意：如果CHO細胞等細胞含有導致熒光染料隨時間泄漏的有機陰離子轉運蛋白，應制備丙磺舒儲備溶液，并加入到加樣緩沖液中，終孔內工作濃度范圍為1到2.5 mM。 未使用的丙磺舒儲備溶液可以在≤-20℃下儲存。 由于佳染色條件可能因細胞類型的不同而異，因此建議單獨確定組分A和B的適當濃度。有關細胞樣品制備的指南，請點擊查看。

 

操作步驟

1.用酶標儀或熒光顯微鏡進行細胞活力測定：

1.1根據需要用測試化合物處理細胞。注意：在添加化合物之前不必洗滌細胞。然而，如果測試的化合物對血清敏感，則可在添加化合物之前吸出生長培養基和血清因子。在抽吸后加入100μL/孔/ 96孔板和25μL/孔/ 384孔板的1X Hank鹽溶液和20mM Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液。或者，細胞可以在無血清培養基中生長。

1.2加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的CytoCalcein TM Green / Propidium Iodide染料加工溶液。

1.3將板在室溫或37°C孵育30分鐘至1小時，避光。 （孵育時間可以從15分鐘到過夜。我們得到了佳結果，孵育時間少于4小時）。注意：適當的孵育時間取決于所使用的單個細胞類型和細胞濃度。優化每個實驗的孵育時間。裝載后請勿清洗細胞。對于非粘附細胞，建議在孵育后以800rpm離心細胞板2分鐘，然后關閉制動器。

1.4使用熒光酶標儀（底部讀取模式）在Ex / Em = 490 / 525nm（截止= 515nm）和Ex / Em = 540 / 620nm（截止= 590nm，細胞死亡）或熒光下監測熒光強度用于活細胞的FITC過濾器或用于死細胞的TRITC過濾器的顯微鏡。

 

2.使用流式細胞儀進行細胞活力測定：

2.1用測試化合物處理細胞一段所需的時間。

2.1離心細胞，得到1-5×105個細胞/管。

2.3將細胞重懸于500μL的CytoCalcein?Green / Propidium Iodide染料加工溶液中。

2.4在室溫或37°C孵育10至30分鐘，避光。

可選：用HHBS或您選擇的緩沖液清洗細胞。 將細胞重懸于500μLHHBS中，每管加入1-5×105個細胞。

2.5用流式細胞儀在Ex / Em = 490 / 525nm和Ex / Em = 490 / 620nm（FL1和FL2通道）下監測熒光強度。

 

數據分析

圖1.使用Cell Meter Cell Viability Assay Kit測量Jurkat細胞對皂苷誘導的細胞死亡的影響。 用或不用0.5％皂苷處理2×10 6個細胞/ mL的Jurkat細胞5分鐘。 離心細胞，用新鮮培養基替換上清液。 將100uL未處理的細胞（A），各50μL未處理和處理的細胞（B），25uL未處理的和75uL處理的細胞（C）和100uL的0.5％皂苷處理的細胞（D）接種在 96孔黑色墻壁/透明底部聚-D-賴氨酸板。 將細胞與100μL/孔的CytoCalcein Green / Propidium Iodide染料 - 工作溶液在37℃下孵育1小時。 使用NOVOstar儀器（BMG Labtech）在底部讀取模式下在Ex / Em = 490 / 525nm和540 / 650nm下測量熒光強度。 如所示（n = 6）顯示活細胞和死細胞上490 / 525nm與540 / 650nm熒光強度的比率。

 

參考文獻

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Live or Dead 細胞活性檢測試劑盒 *紅/藍雙色熒光*	Cat#22788