實(shí)驗(yàn)方法

1.試劑準(zhǔn)備

Peko Green是以1毫升的濃縮液形式保存在無水DMSO（二甲基亞砜）中。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，配制2x Peko Green試劑的工作溶液,用1xTE液（10mM的Tris-HCl，1mM EDTA中，pH值為7.5）按1:200的比例稀釋濃縮液。如果要準(zhǔn)備好足夠的工作液檢測20個樣品，可在20毫升1xTE加入100μL Peko Green dsDNA定量試劑。由于試劑容易吸附到玻璃表面，要在一個塑料容器中配制。Peko Green試劑容易光降解，所以應(yīng)將配好的溶液用箔包主或放置暗處避光保存。溶液最好在配制數(shù)小時內(nèi)使用，以保證最佳結(jié)果。

2.DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品工作液的配制：

Sigma小牛胸腺DNA干粉（貨號：D4522-1MG）1mg (Tris, NaCL等濃度已成標(biāo)準(zhǔn)體系)，加入1mL雙蒸水，配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品工作液的稀釋：

母液稀釋：取10mL(1mg/mL) 標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到990 μLTE溶液中，稀釋成10μg/mL。再取10μL（10mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到990 μLTE溶液中，稀釋成100ng/mL。

倍比稀釋：取800μL(100ng/mL) 標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到200 μLTE溶液中，稀釋成80ng/mL（藥典規(guī)定：熒光染色方法DNA含量在。25-80ng/mL范圍線性較好，此方法DNA檢出限為0.3ng/mL）。再取500mL（80ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入到500 mLTE溶液中，濃度稀釋到40ng/mL。然后按倍比稀釋成20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，見表1。

表 1標(biāo)準(zhǔn)品工作液及樣品排續(xù)在一個實(shí)心的黑色96孔板*

*備注: DS= 標(biāo)準(zhǔn)品工作液從0到40ng/mL平行樣品

3.雙鏈DNA樣品分析

3.1倍比稀釋后的各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品，和染料工作液各取100μL混勻，避光室溫放置5分鐘見表1。

備注: 如果用 384孔板, 則倍比稀釋后的各梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品，和染料工作液各取25mL即可。

3.2用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)/發(fā)射波長= 490/525 nm（截止波長為510 nm）檢測熒光強(qiáng)度。

3.3樣品DNA 含量可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線算出。