Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒是百螢生物生產(chǎn)的一種基于 WST-8 的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。其主要成分為水溶性四唑鹽 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，WST-8 是一種類似于 MTT 的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的水溶性的甲臜（formazan)。WST-8 被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠直接溶解在培養(yǎng)基中。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺;顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供最優(yōu)質(zhì)的熒光探針。

• CCK-8 細(xì)胞增殖與活性檢測的專家
• CCK-8 常見問題詳解

產(chǎn)品特點(diǎn)

本試劑盒提供了一種靈敏度高，操作簡便，使用安全的細(xì)胞增殖與活性檢測方法。與傳統(tǒng)的 MTT 實(shí)驗(yàn)相比具有明顯的優(yōu)勢：

1.MTT實(shí)驗(yàn)生成的甲臜不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；而本方法產(chǎn)生的甲臜是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

2.與 MTT 方法相比，本方法線性范圍更寬，靈敏度更高。

3.本方法對細(xì)胞無毒性，可以多次測定，選取最佳測定時(shí)間。

4.本方法所用試劑在培養(yǎng)基中比 MTT 更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好。

5.MTT 具有毒性，同時(shí)其生成的甲臜需要有機(jī)溶劑溶解，會對操作人員身體造成危害。本試劑無毒，使用中無需有機(jī)溶劑，操作更加安全。

6.本試劑盒在-20°C 避光可長期保存，使用無需配制，即開即用。

本試劑盒可以用于生物活性因子的活性檢測，抗腫瘤藥物的篩選，細(xì)胞增殖的測定，細(xì)胞毒性檢測以及藥敏等與細(xì)胞活性和增殖相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。本試劑盒使用方便，試劑盒包含一管已經(jīng)配制好的含有 WST-8 的 CCK-8 溶液，即開即用，無需其他準(zhǔn)備步驟。檢測過程也無需采用額外的步驟去溶解甲臜，可直接使用 96 孔板或者 384 孔板在酶標(biāo)儀上檢測，適合大規(guī)模，高通量的樣品檢測。

實(shí)驗(yàn)方案

1.在96 孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液（通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100μL2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100μL5000個(gè)細(xì)胞。具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定)。按照實(shí)驗(yàn)需要，進(jìn)行培養(yǎng)（在37°C，5%CO2的條件下）預(yù)培養(yǎng)24 小時(shí)。

2.向培養(yǎng)板加入1-10μL 不同濃度的待測藥物刺激。

3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24 或48 小時(shí)）。

4.每孔加入10μLCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD 值的讀數(shù)）。如果起始的培養(yǎng)體積為200μL，則需加入20μLCCK-8溶液，其它情況以此類推。可以用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。如果擔(dān)心所使用的藥物會干擾檢測，需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。

5.在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，對于大多數(shù)情況孵育1小時(shí)就可以了。時(shí)間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。

7.如果暫時(shí)不測定OD 值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK 之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

注意事項(xiàng)：

1.由于使用96孔板進(jìn)行檢測，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，一定要注意蒸發(fā)的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

2.CCK-8檢測細(xì)胞活性的原理是通過檢測活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設(shè)法去除。

3.建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

4.建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK 試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加樣，容易產(chǎn)生氣泡，會干擾OD 值讀數(shù)。

5.當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 μL培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 μL培養(yǎng)基)，且培養(yǎng)時(shí)間長一些。如果要使用24 孔板或6 孔板實(shí)驗(yàn)，請先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6.加入CCK -8溶液時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基顏色已變化或pH值變化。建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

7.如果沒有450nm 的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

8.酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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試劑應(yīng)用文獻(xiàn)